Образование активных форм кислорода и оксидативная модификация макромолекул — нормальные и важные биологические процессы. Но образование избытка кислородных радикалов может повреждать клетки и способствовать развитию многих болезней. Антиоксидантная система защищает клетки от повреждений. Открыта редокс-регуляция многих важных процессов.

В. И. КУЛИНСКИЙ

Иркутский государственный медицинский университет

Владимир Ильич Кулинский, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой биохимии Иркутского государственного медицинского университета, действительный член Международной академии наук высшей школы. Область научных интересов — регуляция гормонами и вторыми посредниками окислительно-восстановительных процессов и устойчивости организма к экстремальным факторам. Автор 395 публикаций, включая 191 статью и четыре учебных пособия.

ВВЕДЕНИЕ

Человек в покое вдыхает около 280 мл О2 /мин, или не менее 400 л/сут, что соответствует 18 молям О2 . Основное количество О2 (95-98%) расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов. Относительно небольшая часть (2-5%) переходит в активные формы кислорода (АФК) [1, 2] и затем частично используется для оксидативной модификации (ОМ) макромолекул. Это означает, что в АФК переходит ~ 0,4-0,9 моля О2 . При отсутствии метаболизма средняя концентрация АФК в организме достигла бы 6-14 мМ. Однако реальный уровень в тканях равен 10- 8 М, то есть в 106 раз меньше [2]. Возникают вопросы: 1) какое значение имеют АФК и ОМ макромолекул — это просто утечка с главного пути использования О2 или важные процессы, но тогда они полезны или вредны; 2) как осуществляется мощный метаболизм АФК и активных окисленных молекул и почему это нужно?

ПУТИ ОБРАЗОВАНИЯ И МЕТАБОЛИТЫ

Кроме полного четырехэлектронного восстановления молекулы О2 до воды в дыхательной цепи митохондрий в аэробных клетках всегда происходит и неполное — одно-трехэлектронное восстановление с последовательным образованием различных АФК. Это свободный радикал-анион супероксид , перекись водорода Н2О2 и наиболее активный радикал — гидроксил НОJ (реакции (1)):

Донорами электрона могут быть Fe2 +, Сu+ или семихиноны, а для второй и третьей реакций — также и :

H2O2 + Fe2 + HO- + HOJ + Fe3 +

Термин «АФК» шире, чем «свободные радикалы кислорода» (, НОJ), так как кроме последних включает также молекулы Н2О2 , синглетный кислород 1О2 , озон О3 и гипохлорит HOCl.

АФК генерируются во всех частях клетки. Наибольший вклад вносит дыхательная цепь митохондрий, особенно при низкой концентрации АДФ. Важна роль и системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматической сети. Участвуют ядерная мембрана и другие части клетки, при этом АФК часто возникают не только спонтанно, но и ферментативно (НАДФН-оксидаза дыхательного взрыва в плазматической мембране и ксантиноксидаза в гиалоплазме). Концентрации АФК в тканях невысоки: Н2О2 — 10- 8 М, — 10-11 М, НОJ < 10-11 М. АФК вызывают образование органических гидропероксидов ROOH — ДНК, белков, липидов, а также малых молекул [1, 3]. ROOH образуются и в реакции с обычным молекулярным О2 при участии ферментов диоксигеназ (реакция (4)) или циклооксигеназ:

RH + O2 ROOH

ROOH по своей структуре подобны Н2О2 (R-O—O-H и Н-О-О-Н) и химически тоже активны, при последующем метаболизме они переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения. Образование ROOH называют перекисным окислением (пероксидацией), а совокупность описанных реакций (рис. 1) теперь именуют ОМ молекул.

АФК вызывают в липидах (L), в основном в остатках полиненасыщенных жирных кислот, цепные реакции с накоплением липидных радикалов LJ, пероксилов LOOJ, гидропероксидов LOOH и алкоксилов LOJ:

Первые три реакции — это инициация и продолжение цепи, а реакция LOOH c Fe2 + создает ее разветвление. Далее образуются диеновые конъюгаты, а затем минорные метаболиты: малоновый диальдегид, этан, пентан и др. [1, 3]. На протяжении многих лет перекисное окисление липидов (ПОЛ) считали преимущественно спонтанным (неферментативным) и неспецифическим самоускоряющимся процессом и ему придавали ведущее значение в ОМ и ее последствиях. Однако затем стало ясно, что: 1) огромное значение имеют и ферментативные реакции типа (4), катализируемые липоксигеназами [4] и циклооксигеназами — первыми ферментами путей, приводящих к образованию специфических регуляторов — эйкозаноидов [5-7]; 2) в организме главными продуктами ПОЛ являются 4-гидроксиалкенали типа С5Н9-СНОН-СН=СН-СНО, то есть снова специфические вещества; 3) большое значение имеет ОМ и других макромолекул — ДНК и белков, усиленно изучаемая в 90-е годы [8, 9].

АФК вызывают ОМ нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. Это приводит к гидропероксидам ROOH (так, из тимина образуется 5-СН2ООН-урацил), а затем к гидроксипроизводным ROH или R(OH)2 , основными из которых являются 8-ОН-2′-дезоксигуанозин и тимингликоль (их определение в тканях и моче используют как индексы ОМ ДНК) [8]. ОМ белков также вызывает образование в организме ROOH, а затем ROH (o- и m-тирозины), R(OH)2 (ДОФА), карбонилов и других окисленных производных; образуются и димеры (дитирозины); происходит также аутооксидативное гликозилирование белков [9].

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

На протяжении длительного времени в биологической и особенно медицинской литературе основной акцент делали на вредных эффектах АФК и ОМ. Они действительно существуют, но теперь уже нет сомнений, что образование АФК и ОМ приносят и пользу.

Эйкозаноиды — это гормоны, производные С20-полиненасыщенных жирных кислот типа арахидоновой. Их разделяют на циклические (простаноиды) и линейные (прежде всего лейкотриены). Промежуточными метаболитами являются пероксиды (соответственно циклический эндопероксид ПГ G2 и 5-НОО-арахидонат). Роль и значение простаноидов кратко описаны в [5]. Кроме того, они защищают от повреждений клетки желудка, сердца и других органов [6]. Липоксигеназа образует первый лейкотриен А4 — 5,6-эпоксид арахидоновой кислоты, который при гидратации переходит в лейкотриен В4 , а при присоединении глутатиона — в лейкотриен С4 . Лейкотриены, как и простаноиды, способствуют развитию воспаления (первично это полезная защитная реакция), при этом лейкотриен В4 вызывает хемотаксис и активацию нейтрофилов; лейкотриен С4 и его метаболит D4 стимулируют сокращение гладких мышц [6, 7].

Серьезной проблемой для многоклеточных организмов является борьба с клетками-врагами. Важную роль в этом играют фагоциты (нейтрофилы и макрофаги), которые захватывают микроорганизмы, а затем убивают их, используя АФК в качестве основного оружия [1], повреждающего макромолекулы и мембраны путем их ОМ. Макрофаги разрушают поврежденные, старые или иммунологически несовместимые клетки, а также способствуют уничтожению злокачественных клеток и клеток, пораженных вирусами. Остеокласты (специализированные макрофаги) применяют АФК для разрушения кости — обязательного условия ее обновления. Во всех этих случаях клетки-защитники быстро поглощают большое количество О2 (дыхательный взрыв) и затем используют его для образования АФК при помощи расположенной в плазматической мембране НАДФН-оксидазы дыхательного взрыва:

2О2 + НАДФН 2 + НАДФ+ + Н+

Важное значение АФК для защиты от бактерий доказывается тем, что при инактивирующей мутации этого фермента возникает хронический септический грануломатоз: фагоцитированные микроорганизмы остаются живыми, что приводит к повторным хроническим инфекциям и чревато сепсисом. Н2О2 используется также для окисления галоген-анионов: в нейтрофилах — Сl- — для образования мощного окислителя гипохлорита HClO, также убивающего бактерии, а в щитовидной железе — J-, что необходимо для синтеза гормонов иодтиронинов.

В последнее время обнаружены новые функции АФК — регуляторные [10, 11]. АФК стимулируют накопление в клетке вторых посредников — циклонуклеотидов: цAMФ и цГМФ, при этом последний образуется в результате активации НОJ (но не другими АФК) гиалоплазматической гуанилилциклазы. АФК вызывают накопление ионов Са2 + в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в результате активации протеинкиназ (особенно протеинкиназы С) и протеинтирозинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз; активируют белок Ras, играющий важную роль в передаче сигналов в ядро клетки. Активно исследуется, не могут ли АФК сами прямо выполнять функции вторых посредников гормонов. В пользу этого свидетельствуют накопление АФК при воздействии факторов роста клеток, цитокинов, инсулина, паратирина, витамина Д3 , модификация эффектов этих гормонов под влиянием АФК и их снижение или блокада антиоксидантами. АФК и липидные ROOH в низких субтоксических концентрациях индуцируют такие процессы, как экспрессия генов (в том числе генов раннего ответа и других протоонкогенов) и деление клеток. Н2О2 , накапливающаяся при инвазии вирусов и бактерий, активирует транскрипционный фактор NF-kB, что приводит к индукции ряда цитокинов и иммунных рецепторов и в результате к иммунным и воспалительным ответам, а также к индукции белков острой фазы и адгезии (последние способствуют выходу лейкоцитов в ткани, что важно при воспалении). Очевидно, роль АФК в защите организма шире, чем предполагалось ранее: она включает не только фагоцитоз опасных клеток, но и запуск других воспалительных реакций и иммунных процессов.

Патологические последствия возникают при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их вторичных продуктов — состоянии, называемом обычно оксидативным стрессом, а факторы и вещества, способствующие этому, называют прооксидантами, эти термины спорны (речь идет не об основных окислительных процессах) [12], но общеприняты. Факторы, вызывающие оксидативный стресс, различны, но все они в конечном счете вызывают ОМ макромолекул. Прежде всего это избыток О2 , особенно при гипербарической оксигенации (лечении кислородом под повышенным давлением) и реперфузии, то есть возобновления кровотока после его нарушения из-за тромбоза (закупорки сосуда) или сильного спазма, характерных для инфаркта миокарда или инсульта головного мозга. Значительная выраженность воспаления с активацией нейтрофилов и макрофагов также неизбежно приводит к накоплению АФК. К другим факторам относят избыток гема, Fe2 + и Cu+, ионизирующие и ультрафиолетовое излучения, курение, витамин Д, большие дозы витамина А и некоторые ксенобиотики. Для последних наиболее важными процессами являются: 1) окисление в пероксисомах (гликолат), митохондриях (амины) или в микросомах (лекарства амидопирин, гексенал, дионин) с образованием Н2О2 ; 2) редокс-циклирование хинонов (менадион, доксорубицин, фурадонин), метронидазола и бипиридильных гербицидов (паракват, дикват), вызывающее аккумуляцию [1, 3, 6, 12].

Оксидативный стресс приводит к повреждению наиболее важных полимеров — нуклеиновых кислот, белков и липидов. Из АФК только НОJ вызывает повреждения ДНК (окисление оснований, их модификации, разрывы цепей, повреждения хромосом), при этом сейчас считают, что АФК вызывают больше мутаций, чем другой класс мутагенов — алкилирующие вещества. Мутации могут привести к патологии и гибели клеток или их злокачественному перерождению (раки, лейкозы и др.), а мутации в ДНК половых клеток — к наследуемым заболеваниям. Высокие концентрации АФК и липидных гидропероксидов ингибируют синтез ДНК и деление клеток и могут активировать апоптоз (программированную смерть клеток), что полезно для организма, так как ценой гибели части клеток предупреждает прогрессирование злокачественных процессов и гибель целого организма [8].

ОМ белков, вызванная АФК, не только изменяет аминокислотные остатки, но и нарушает третичную структуру и даже вызывает агрегацию и денатурацию. В результате снижается или исчезает их многообразная функциональная активность (ферментативная, регуляторная, участие в матричных синтезах, транспорт ионов и липидов), а некоторые из них способствуют мутациям или становятся аутоантигенами [9]. ПОЛ прежде всего повреждает клеточные мембраны. Кроме того, продукты ПОЛ (4-гидроксиалкенали, малоновый диальдегид и др.) являются мутагенными и цитотоксичными [1, 3]. Избыток некоторых эйкозаноидов также дает патологические эффекты: тромбоз и гипертонию (тромбоксаны), гиперчувствительность, участие в патогенезе бронхиальной астмы, шока, инфаркта миокарда, язвы желудка (лейкотриены) [5-7].

Все описанные нарушения могут серьезно или полностью дезорганизовать функционирование клеток и организма в целом, утяжелить или даже вызвать серьезные болезни и привести к смерти и / или наследственной патологии. Оксидативный стресс с накоплением в тканях и биологических жидкостях АФК и вторичных продуктов ОМ макромолекул обнаружен при многих (> 60) болезнях и патологических синдромах, часто называемых свободно-радикальной патологией: старении, различных злокачественных процессах, хроническом воспалении (ревматоидный артрит, гастрит и язва, колиты, цистит и др.), СПИДе, сахарном диабете, атеросклерозе, последствиях инфаркта и инсульта, катаракте, нейродегенеративных заболеваниях (паркинсонизм, болезнь Альцгеймера и др.) и многих других [1, 3, 4, 8, 9]. Правда, далеко не всегда установлены первичность накопления АФК и / или ОМ макромолекул и их важное значение в патогенезе. Многие не учитывают, что эти нарушения могут быть не причиной, а следствием развития болезней. Наконец, важно подчеркнуть, что организм отнюдь не беззащитен по отношению к АФК и ОМ макромолекул.

ЗАЩИТА

Защита осуществляется двумя принципиально различными механизмами: 1) снижением образования первой АФК — путем уменьшения О2 в клетке или его более быстрого использования дыхательной цепью ввиду снятия ее контроля DmН+ [13], 2) функционированием антиоксидантной системы (АОС). Мы рассматриваем только второй механизм.

АОС включает как низкомолекулярные антиоксиданты, так и антиоксидантные ферменты. Концентрации первых представлены в табл. 1. Ясно, что они значительно выше, чем АФК. Гидрофильные восстановленный глутатион (GSH) и аскорбиновая кислота (в мышцах и карнозин) находятся в водной фазе клетки и защищают вещества гиалоплазмы и матрикса митохондрий, а гидрофобные антиоксиданты защищают мембраны. Эти вещества перехватывают свободные радикалы, восстанавливают АФК и продукты ОМ. Отметим, что среди низкомолекулярных антиоксидантов важную роль играют пищевые вещества: витамины С и Е и каротины. Такими же свойствами обладают ураты и билирубин [1, 3, 6, 8], которые ранее считали просто ненужными и даже вредными метаболитами.

Еще более важную роль играют антиоксидантные ферменты. Обычно выделяют три линии защиты: 1) супероксиддисмутаза, 2) селеновая глутатионпероксидаза (ГПО) и каталаза, 3) ГПО и глутатионтрансферазы (рис. 1), а также недавно обнаруженная фосфолипидгидропероксид-ГПО. Супероксиддисмутаза восстанавливает супероксид:

+ + 2Н+ Н2О2 + О2 ,

каталаза — Н2О2 :

2Н2О2 2Н2О + О2 ,

ГПО — Н2О2 и органические гидропероксиды ROOH свободных жирных кислот, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и, вероятно, белков:

Н2О2 + 2GSH 2Н2О + GSSG,

ROOH + 2GSH ROH + H2O + GSSG

Глутатионтрансферазы восстанавливают только ROOH, но важно, что один из изоферментов находится прямо в хроматине и восстанавливает ROOH ДНК в ядре. Фосфолипидгидропероксид-ГПО восстанавливает ROOH жирных кислот в составе фосфолипидов (для этого не требуется предварительный гидролиз последних). Вспомогательным ферментом является глутатионредуктаза, регенерирующая GSH из GSSG путем НАДФН-зависимого восстановления:

GSSG + НАДФН + Н+ 2GSH + НАДФ+

Сопряженная работа этих ферментов показана на рис. 2.

Это уменьшает или даже предупреждает прогрессирование ПОЛ и ОМ нуклеиновых кислот и белков [1, 2, 4, 6, 12]. Однако необходимо обезвреживание вторичных метаболитов ОМ (см. рис. 1) — это четвертая линия защиты [2]. ГТ конъюгирует с GSH ряд окисленных веществ (R(O) на рис. 1), в том числе главный продукт ПОЛ — 4-гидроксиалкенали и опасные эпоксиды. Формальдегиддегидрогеназа и глиоксалаза, использующие GSH в качестве кофермента, окисляют свои субстраты до органических кислот. Кроме того, альдегиддегидрогеназа окисляет малоновый диальдегид. Хинонредуктаза (ДТ-диафораза) обеспечивает двухэлектронное восстановление хинонов в дигидрохиноны, что предупреждает образование вредных продуктов одноэлектронного восстановления — семихинонов; эпоксидгидролаза гидратирует эпоксиды с образованием диолов [2, 12]. В целом ферментативная АОС обеспечивает мощный и эффективный метаболизм не только АФК, но и активных окисленных соединений. В АОС особенно важна роль GSH: 1) это главный восстановитель клетки, его концентрация (1-10 мМ) выше, чем большинства органических веществ; 2) как и другие низкомолекулярные антиоксиданты, он прямо восстанавливает АФК; 3) функционирует на трех линиях ферментативной защиты (восстановление Н2О2 , ROOH и обезвреживание вторичных метаболитов ОМ) из четырех; 4) GSH-зависимые ферменты работают во всех частях клетки, включая ядро, митохондрии и эндоплазматическую сеть. Известный антиоксидатный эффект Se также в основном опосредован ферментами — обеими ГПО [2, 12].

Важность АОС доказывается: 1) накоплением АФК и нарастанием ОМ при дефиците низкомолекулярных антиоксидантов: GSH, витаминов Е и С; 2) гибелью нейронов спинного и головного мозга при инактивирующей мутации СОД (амиотрофический латеральный склероз); 3) развитием при серьезном дефиците GSH или GSH-зависимых ферментов гемолиза эритроцитов, катаракты хрусталика и поражения печени проксидантными ядами (ССl4 и др.). Неудивительно, что оксидативный стресс возникает не только при избыточности АФК и ОМ макромолекул, но и при недостаточности АОС (не только абсолютной, но и относительной). Следовательно, оксидативный стресс — это сдвиг к преобладанию прооксидантов над антиоксидантами.

Но АОС выполняет и другую важную функцию. Она снижает или даже предупреждает большинство эффектов, вызываемых АФК и OМ макромолекул: активацию протеинкиназы С, фактора NF-kB, экспрессии генов (в том числе протоонкогенов) и апоптоза, действие гормонов типа факторов роста клеток и цитокинов, тормозит прогрессирование СПИДа. Это не только стало дополнительным и независимым подтверждением регуляторных функций АФК, но и привело к признанию регуляторных функций АОС, к рождению концепции внутриклеточной редокс-регуляции, определяемой соотношением прооксидантов и антиоксидантов [10, 11]. Возникли и определенные надежды на антиоксидантную профилактику злокачественных процессов путем применения природных (витамины Е, С и каротины) и синтетических антиоксидантов. Сейчас это усиленно проверяется.

Если ОМ происходит и повреждает макромолекулы, то клетка вынуждена их разрушать: активируется катаболизм полимеров, осуществляемый пептидазами, фосфолипазами (особенно А2) и нуклеазами [8, 9], а затем новые синтезы восполняют убыль. Для ДНК включается и механизм репарации — хорошо известно, что это единственные биомолекулы, для которых он существует.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Во всех клетках и всех их частях происходят образование АФК и ОМ макромолекул всех классов: нуклеиновых кислот, белков и липидов. Это минорные, но обязательные биологические процессы, выполняющие очень важные функции. Одна из них — синтез эйкозаноидных гормонов: простаноидов и лейкотриенов, а также участие в синтезе иодтиронинов. АФК и ОМ необходимы для иммунитета и воспаления, так как: а) увеличивают синтез цитокинов и иммунных рецепторов; б) способствуют выходу лейкоцитов в ткани; в) убивают фагоцитированные бактерии, старые и поврежденные клетки и способствуют повреждению несовместимых, а также злокачественных и пораженных вирусами клеток. Но избыточность АФК и ОМ повреждает клетки и может способствовать развитию очень многих болезней и синдромов, в том числе самых распространенных и опасных: старения, атеросклероза, инфаркта и инсульта, тяжелых воспалительных заболеваний, СПИДа, злокачественных процессов и др. Поэтому существует защитная антиоксидантная система. Она состоит из низкомолекулярных антиоксидантов и антиоксидантных ферментов. Соотношение прооксидантов и антиоксидантов и определяет, разовьется ли и будут ли прогрессировать оксидативный стресс и в результате свободно-радикальная патология. Это же соотношение участвует в регуляции многих очень важных биологических процессов, то есть существует новая форма контроля — редокс-регуляция.

ЛИТЕРАТУРА

1. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. Т. 29.

2. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. // Успехи соврем. биологии. 1993. Т. 113, вып. 1. С. 107-122.

3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.

4. Ланкин В.З. // Укр. биохим. журнал. 1984. Т. 56, ╧ 3. С. 317-331.

5. Варфоломеев С.Д. Простагландины — новый тип биологических регуляторов // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. ╧ 1. С. 40-47.

6. Кулинский В.И. Лекционные таблицы по биохимии. Иркутск: Иркут. мед. ин-т, 1994. Вып. 4: Биохимия регуляций. 94 с.

7. Сала А., Зарини С., Бола М. // Биохимия. 1998. Т. 63, ╧ 1. С. 101-110.

8. Wiseman H., Halliwell B. // Biochem. J. 1996. Vol. 313, ╧ 1. P. 17-29.

9. Dean R.T., Fu Sh.,Stocker R., Davies M.J. // Ibid. 1997. Vol. 324, ╧ 1. P. 1-18.

10. Suzuki Y.J., Forman H.J., Sevanian A. // Free Radical Biol. Med. 1996. Vol. 22, ╧ 1/2. P. 269-285.

11. Lander H.M. // FASEB J. 1997. Vol. 11, ╧ 1. P. 118-124.

12. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. // Успехи соврем. биологии. 1990. Т. 110, вып. 1(4). С. 20-33.

13. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: Добро и зло // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. ╧ 3. С. 4-10.